細(xì)胞侵襲實驗準(zhǔn)備程序
A、試劑準(zhǔn)備:
1、C 緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清 DMEM 等，用于稀釋 A 膠) 稀釋 C 緩沖溶液 (10 X) (貨號: B-P-00003-C)至 C 緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋 20 倍。使用放置 37 度水浴槽。 (例如:1 mL C 緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清 DMEM; 如未使用完畢，可保存于 4 ℃ 冰箱, 保存一周)
2、A 膠 (1X) 制備 : 將 A 膠 (2X) (貨號: B-P-00003-A) 置于 37 ℃水浴槽回溫 10 分鐘，確認(rèn)溶解。再將 37 ℃水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液取 0.5 mL，加至 37 ℃已溶解的 0.5 mL A 膠 (2X)，配置成 1 mL的 A 膠 (1X)。使用置于 37 度，可降低 A 膠黏度。(單次使用，勿重復(fù)冷凍解凍 A 膠 (1X) )
B、細(xì)胞侵襲實驗步驟
1、準(zhǔn)備適用 24 孔板的 Transwell 裝置(例如:康寧 Transwell insert, 8 μm PET membrane)。
2、用 37 ℃已回溫的 C 緩沖溶液 (0.5 X)將 A 膠 (1X) 原液體積稀釋 5-20 倍，建議一開始可選用 15 倍。
(根據(jù)細(xì)胞種類做稀釋比例對比實驗，找出適合自己實驗體系的稀釋倍數(shù)，稀釋倍數(shù)越高，膠體越軟，越容易穿透)
3、根據(jù) Transwell 上室底部面積加入步驟 2 的 0.1 mL 稀釋后的 A 膠稀釋液到 Transwell 上室中。
4、將步驟 4 在 4 ℃ 冰箱孵育 2-3 小時。
5、在 Transwell 上室中加入 0.1 mL 無血清的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞終濃度約 7.5 x 104 cells/well.。
6、在 Transwell 下室中加入 0.8 mL 含 10 %血清的細(xì)胞培養(yǎng)液做為 chemoattractant，吸引細(xì)胞進行遷移及分泌基質(zhì)蛋白酶 (MMP) 侵襲。 (對照組為 Transwell 下室中加入含 0.8ml 無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液)。
7、將細(xì)胞培養(yǎng)板在 37 ℃, 5 % CO2 培養(yǎng)箱孵育 24-48 小時。
8、移除培養(yǎng)液，以 PBS 清洗 2 次。
9、用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細(xì)胞。
10、加入 1 ml 100 % 甲醇室溫固定 30 分鐘,再以 PBS 清洗 2 次。
11、加入 1 ml 0.1 % 結(jié)晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 結(jié)晶紫) 室溫染色 20 分鐘，再以 PBS 清洗 2 次。
12、將 Transwell 移至載玻片上，在顯微鏡下隨機 6-9 個視野觀察計算遷移的細(xì)胞數(shù)。
上海市楊浦區(qū)國康路100號2層
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